Western blot實(shí)驗(yàn)過程中常見問題匯總及處理方案。

1、western blot 的優(yōu)點(diǎn)及缺點(diǎn)

答： 優(yōu)點(diǎn)：靈敏，特異性高，常規(guī)可達(dá)ng級，Ecl顯色法理論上可達(dá)pg 級。

     缺點(diǎn)：通量有限。

2、為什么我的細(xì)胞提取液中沒有目標(biāo)蛋白？

答： 原因有很多：首先排除WB過程是不是抗體的問題，重新實(shí)驗(yàn)、更換抗體；其次排除蛋白是否降解，提取的時候需要加入蛋白酶抑制劑， a) 你的細(xì)胞中不表達(dá)這種蛋白質(zhì)，換一種細(xì)胞；最后考慮此種細(xì)胞是否表達(dá)該蛋白，表達(dá)量高低。

3、提取液有的有沉淀，有的很清亮，為什么呢？

答： a) 有沉淀可能因?yàn)槟愕牡鞍讻]有變性*，可以適當(dāng)提高SDS 濃度，同時將樣品煮沸時間延長， b) 也不排除你的抗原濃度過高，這時再加入適量上樣緩沖液即可。

4、蛋白質(zhì)分子量很小（10KD），WB實(shí)驗(yàn)過程該注意哪些問題？

答：可以選擇0.2μm的PVDF膜，同時縮短轉(zhuǎn)膜時間。

5、目的條帶很弱，如何加強(qiáng)？

答：可以加大抗原上樣量，這是最主要的。同時也可以將一抗稀釋比例降低。

6、膠片背景很臟，解決方法？

答：減少抗原上樣量，降低一抗?jié)舛龋淖円豢狗跤龝r間，提高封閉時間。

7、目標(biāo)帶是空白，周圍有背景，是為什么？

答：你的一抗?jié)舛容^高，二抗上HRP 催化活力太強(qiáng)，同時你的顯色底物處于一個臨界點(diǎn)，反應(yīng)時間不長，將周圍底物催化完，形成了空白即“反亮現(xiàn)象"。將一抗和二抗?jié)舛冉档停蚋鼡Q新底物。

8、我的膠片是一片空白，是怎么回事？

答：如果能夠排除下面的幾個問題那么問題多半出現(xiàn)在一抗和抗原制備上。

a) 二抗的HRP 活性太強(qiáng)，將底物消耗光；

b) ECM底物中H2O2，不穩(wěn)定，失活；

c) ECL底物沒覆蓋到相應(yīng)位置；

d) 二抗失活。

9、我在顯影液中顯影1分鐘和5分鐘后,底片漆黑一片,是什么原因呢?

答：a) 可能膠片被曝光了，可以在*黑暗的情況下操作.看是否有改善.；b) 顯影時間過長。

10、DAB好還是ECM好？

答：DAB 有毒，但是比較靈敏，是HRP 最敏感的底物；ECM結(jié)果容易控制，但被催化時靈敏度差一點(diǎn)，但如果達(dá)到閥值，就特別靈敏，可以檢測pg 級抗原。要看你實(shí)驗(yàn)的情況。

11、抗原檢測出的分子量比資料上的大，是怎么回事？

答：a)抗原形成了二聚體。增多巰基乙醇量，煮沸變性時間延長，可以打開二聚體。b)蛋白本身的修飾如：糖基化，磷酸化等。

12、蛋白轉(zhuǎn)移不到膜上，但膠上有，同時Marker 轉(zhuǎn)上去了，為什么？

答：可能是：a)樣品濃度過低；b)轉(zhuǎn)移時間不夠。

13、磷酸化抗體的檢測樣本制備時是否一定要加NaF等？

答：NaF是一種廣譜磷酸化酶的抑制劑，一般最好加。但是不加也可以，大部分時候是不用加的。

14、要驗(yàn)證某個細(xì)胞上有無該蛋白的存在，需要做免疫組化和western blot試驗(yàn)嗎？做這兩個試驗(yàn)時的一抗和二抗可以共用嗎？

答： ① 免疫組化可以用來進(jìn)行定位，但是不能精確定量，而且有時會有假陽性，不易與背景區(qū)分；Western blot可以特異性檢測某個蛋白質(zhì)分子，進(jìn)行定量，但是不能定位。

② 兩種實(shí)驗(yàn)的一抗有時候不能通用，公司的產(chǎn)品說明一般都會說明可以進(jìn)行什么實(shí)驗(yàn)，在免疫組化時，是否適合石蠟切片或者冰凍切片。

15、做Western Blot時，提取蛋白后凍存（未加蛋白酶抑制劑），用的博士德的一抗，開始還有點(diǎn)痕跡，現(xiàn)在越來越差，上樣量已加到120μg，換了個santa cloz的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制劑單加PMSF行嗎？

答：懷疑是樣品問題，可能是：

1，樣品不能反復(fù)凍融；

2，樣品未加蛋白酶抑制劑。同時，建議檢查Western Blot過程， 提高一抗?jié)舛取τ诩拥鞍酌敢种苿﹣碚f，一般加PMSF就可以了，最好能多加幾中種蛋白酶抑制劑。

16、細(xì)胞水平要做western blot，多少細(xì)胞提的蛋白夠做western blot？

答：一般5×10^6就足夠了。

17、同一樣品能同時提RNA又提蛋白么？這樣對western blot有無影響？

答：能，沒有問題。有商品化的試劑盒可以滿足。

18、同一蛋白樣品能同時進(jìn)行兩種因子的Western Blot檢測嗎？

答：當(dāng)然可以，有的甚至可以同時測幾十種樣品。

19、如果目標(biāo)蛋白是膜蛋白或是胞漿蛋白，操作需要注意什么？

答：如果是膜蛋白和胞漿蛋白，所用的去垢劑要溫和得多，這時最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。

20、我的樣品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在轉(zhuǎn)膜時經(jīng)常會發(fā)現(xiàn)只有一部分蛋白轉(zhuǎn)到了膜上，就是在轉(zhuǎn)膜后染膠發(fā)現(xiàn)有的孔所有的蛋白條帶都在，只是顏色變淡了，有什么辦法可以解決？

答：你可以加大上樣量，沒有問題，還有轉(zhuǎn)移時你可以用減少電流延長時間，加20％甲醇。