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質(zhì)粒提取竅門

日期:2021-08-12瀏覽:3106次

       提取質(zhì)粒DNA的方法有很多種,從提取產(chǎn)量上分可分為微量提取、中量提取、大量提取,從使用儀器上分可分為一般提取和試劑盒方法提取,從具體操作方法分可以分為堿裂解法、煮沸法等,各種不同的方法各有其優(yōu)缺點(diǎn),根據(jù)不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康目梢圆捎煤线m的提取方法。

堿裂解法:

       使用堿與SDS裂解法從E. coli(大腸桿菌)中分離制備質(zhì)粒DNA已有30多年的歷史。將細(xì)菌懸浮液暴露于高pH值的強(qiáng)陰離子洗滌劑中,會使細(xì)胞壁破裂,染色體DNA和蛋白質(zhì)變性,將質(zhì)粒DNA釋放到上清中。堿性溶劑使堿基配對*破壞,閉環(huán)的質(zhì)粒DNA雙鏈仍不會彼此分離,這因?yàn)樗鼈冊谕負(fù)鋵W(xué)上是相互纏繞的。只要OH-處理的強(qiáng)度和時(shí)間不要太過,當(dāng)pH值恢復(fù)到中性時(shí),DNA雙鏈就會再次形成。在裂解過程中,細(xì)菌蛋白質(zhì)、破裂的細(xì)胞壁和變性的染色體DNA會相互纏繞成大型復(fù)合物,后者被十二烷基硫酸鹽包蓋。當(dāng)用K+取代Na+時(shí),復(fù)合物會從溶液中有效地沉淀下來,離心除去變性劑后,就可以從上清中回收復(fù)性的質(zhì)粒DNA。在SDS存在的條件下,堿水解是一項(xiàng)非常靈活的技術(shù),它對E. coli的所有菌株都適用,并且其細(xì)菌培養(yǎng)物的體積可以從1-500mL以上。

       質(zhì)粒小提試劑盒,它結(jié)合了優(yōu)化的堿裂解法,以及方便快捷的硅膜離心技術(shù),具有高效,快捷的特點(diǎn),能在30min內(nèi)完成全部操作。利用試劑盒能從1-5mL過夜培養(yǎng)的大腸桿菌菌液中純化得到10-40μg高質(zhì)量的質(zhì)粒DNA(OD260/OD280=1.7-1.9),此質(zhì)粒DNA可直接用于DNA序列分析,各種酶促反應(yīng),PCR以及部分細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染等。

煮沸法:

        煮沸法是將細(xì)菌懸浮于含有Triton X-100和能消化細(xì)胞壁的溶菌酶的緩沖液中,然后加熱到100℃使其裂解。加熱除了破壞細(xì)菌外壁,還有助于解開DNA鏈的堿基配對,并使蛋白質(zhì)和染色體DNA變性。但是。閉環(huán)質(zhì)粒DNA鏈彼此不會分離,這是因?yàn)樗鼈兊牧姿岫ス羌芫哂谢ハ嗬p繞的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)。當(dāng)溫度下降后,閉環(huán)DNA的堿基又各就各位,形成超螺旋分子,離心除去變性的染色體DNA和蛋白質(zhì),就可從上清中回收質(zhì)粒DNA。煮沸裂解法對于小于15kb的小質(zhì)粒很有效,可用于提取少至lmL(小量制備),多至250mL(大量制備)菌液的質(zhì)粒,并且對大多數(shù)的大腸桿菌菌株都適用。但對于那些經(jīng)變性劑、溶菌酶及加熱處理后能釋放大量碳水化合物的大腸桿菌菌株,則不推薦使用該法。這是因?yàn)樘妓衔锖茈y除去,會抑制限制酶和聚合酶活性。若碳水化合物的量很大,在CsCl-溴化乙錠梯度離心中會使超螺旋質(zhì)粒DNA帶變得模糊不清。大腸桿菌菌株HBl01及其衍生菌株(其中包括TGl)能產(chǎn)生大量的碳水化合物,不適于用煮沸法裂解。


抽提竅門及注意事項(xiàng):

1、加裂解液后,操作一定要溫和,劇烈混合會導(dǎo)致基因組DNA污染。

2、洗脫時(shí)60℃溫育(Ellution Buffer)洗脫緩沖液或去離子水效果更好。

3、若質(zhì)粒提取含量低,可增加菌液樣或換用ArtMedia Plasmid Culture,其比LB培養(yǎng)基質(zhì)粒得量高。

4、菌體應(yīng)*懸浮 , 如果沒有*懸浮菌體,則殘留的菌體團(tuán)塊在溶液 II 加入后,變成難以*裂解的團(tuán)塊。這個(gè)團(tuán)塊在溶液 III 加入后,會有一部分蛋白質(zhì)繼續(xù)存在于溶液中,成為蛋白質(zhì)殘留的最大根源。

5、加入溶液 II 后,混勻,體系最好能立即變得清澈。體系如果變得清澈了,馬上加入溶液 III 中和。

6、中和的操作 ,在 1.5ml 離心管中加入溶液 III 后,先顛倒兩次,使管底朝上,用指頭彈擊管底數(shù)次,再顛倒混勻。效果非常好。


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